【RMC超薄切片机-ASH2 】多模态分层成像用于在大体积组织中定位特定细胞靶标

发表时间：2026-07-20 14:36

多模态分层成像用于在大体积组织中定位特定细胞靶标

作者：

Irene U. Wacker1,2, Lisa Veith3, Waldemar Spomer2,4, Andreas Hofmann2,4, Marlene Thaler5, Stefan Hillmer6, Ulrich Gengenbach2,4, Rasmus R. Schröder1,2,3

关键词：

发育生物学，第133期，阵列断层扫描，大容量电子显微镜，扫描电子显微镜，荧光光学显微镜，光与电镜关联成像，CLEM，分层成像，自动化成像，靶向

体电镜技术

摘要

本研究提出一种融合光学显微镜（LM）与扫描电子显微镜（SEM）的多模态分层成像技术，可在混合细胞群体或完整组织中实现特定细胞靶标的超微结构分辨率定位与三维解析。该方法首先将样本经树脂包埋后，利用超薄切片机连续切取数百张超薄切片，并将其有序排列为条带阵列，转移并固定于硅基底或导电涂层盖玻片上。随后，采用智能手机相机或宽场光学显微镜（LM）对整套阵列进行低分辨率快速成像，获取大视场结构概览；若样本经荧光标记，则进一步通过宽场荧光显微镜（FLM）采集多通道荧光图像，用于细胞类型识别与初步三维重建。完成光学成像后，阵列经锇酸/醋酸铀等重金属染色增强对比度，继而置于扫描电子显微镜（SEM）中进行逐层高分辨率成像。在无荧光标记条件下，目标区域可基于FLM三维重建结果或SEM图像堆栈生成的中等分辨率三维模型进行精准选取；最终，选定靶区可在SEM下以数纳米级像素分辨率（<5 nm）完成超微结构成像。本文同时开发了一种兼容通用超薄切片机的条带转移与基底分离工具，显著提升阵列制备的可靠性与操作效率；并构建了一套支持阵列自动导航、聚焦与拼接的SEM软件平台，实现高通量、高重复性的三维电镜数据采集。相较于连续块面扫描电镜（SBF-SEM）和聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）等主流三维电镜技术，本方法具备两项关键优势：（1）树脂包埋样本以物理切片形式完整保留，支持多重染色、多模态复用及跨分辨率成像；（2）SEM成像所需的对比度与导电性可通过切片后染色实现，避免了传统块面染色对组织超微结构的潜在损伤及对强渗透性重金属预处理的依赖，从而拓展了方法对临床固定样本（如病理活检库来源组织）的适用性——此类样本可直接包埋、切片、染色并完成三维超微结构重建。

研究介绍

1现有大体积电镜技术短板

目前用于组织超大体积超微三维重构的 SEM 技术主要有 SBF-SEM、FIB-SEM 与阵列断层成像 AT：前两者为块面破坏性成像，成像过程会消耗样品；且树脂样品易在电镜下荷电，需要对样品块进行大量重金属整体染色，重金属会淬灭荧光信号，无法适配荧光光镜 - 电镜关联成像（CLEM）。

2阵列断层成像 AT 核心优势

样品以连续超薄切片条带阵列形式保留，不会被损毁，可多次复染、多分辨率重复成像；
支持切片后重金属后染色，无需前期高强度整体金属化，适配荧光标记，病理存档活检、高压冷冻弱金属化样本均可直接使用；
具备层级多分辨率成像能力：无需全样本高分辨拍摄，先低 / 中分辨率定位目标细胞，仅对感兴趣区域高分辨采集，大幅节省存储与拍摄时间。

3多模态 CLEM 工作逻辑

结合宽场荧光显微镜（FLM）与扫描电镜（SEM）：先荧光成像三维重构定位目标细胞，再重金属后染色，分梯度分辨率 SEM 采集超微结构，实现 “光镜定位 + 电镜纳米级超微观察”。

实验操作流程

图1：关联性分层成像的工作流程。从嵌入树脂块中的样本（A，强金属化样本）开始，首先对样本进行修整（B，弱金属化样本），然后使用超薄切片机制备由多个连续切片条带组成的阵列（C），此处将切片放置于ITO涂层盖玻片上。经荧光染色后，在宽场荧光显微镜（FLM）中记录图像堆栈（D）。随后通过多次重金属盐染色，再在扫描电镜（SEM）中以不同分辨率（图像像素尺寸）对样本进行成像（E-G）。

图2：用于制备阵列的工具。由七轴微操作器组装而成的基底固定装置，安装在标准超薄切片机上（A）：标有圆圈的螺丝用于基底载台的垂直（1）、水平（2）移动以及倾斜（3）。带有超大尺寸刀槽以容纳大型基底的巨型金刚石刀片（箭头所示），此处将一片等离子体活化的硅晶圆固定在滑片大小的铝制载台上（B）。将20 µL的蒸馏水滴加到未经处理的硅晶圆基底上（C）或等离子体活化后的基底上（D）。四条细带悬浮于刀槽中，其下端连接至ITO涂层盖玻片。

图3：LM数据与SEM数据的相关性。使用FLM（A、B）和SEM（C、D）记录的概览图像（A、C）和目标细胞（B、D）。（B）为软件缩放，原始数据采用40倍物镜在1,388 × 1,040像素的相机芯片上采集；而（C）以60纳米图像像素尺寸记录，（D）以5纳米图像像素尺寸记录，展示了SEM分辨率的真实提升。

图4：使用蔡司Atlas 5 AT在扫描电镜中进行分层成像。A为使用二次电子探测器以1000 nm图像像素记录的阵列概览；B为在每层切片上将感兴趣区域（ROI）定位在组织上的切片组，以60 nm图像像素记录；C为在目标细胞上设置连续感兴趣区域（ROI）并以5 nm图像像素记录的位点组；当放大至此类高分辨率图像（D）时，可观察到细胞内的膜结构区室，如液泡（V）、细胞核（N）、线粒体（M）以及内质网（箭头所示）。

图5：典型问题。1. 切片过程中产生的问题：放置在ITO涂层盖玻片上的条带理想情况下应为笔直（A），但切片时不规则的压缩可能导致条带弯曲（B）或呈弧形（D），甚至出现褶皱（C）。2. 由于在水中操作基底和条带所致，例如在切片和染色过程中：基底上出现散射光颗粒（D）、切片边缘残留液滴痕迹（E中的圆圈），或因染色后冲洗不彻底导致污物扩散至组织表面（F）。

结果

1. 代表性实验结果

以拟南芥高压冷冻植物根组织（弱金属化样本）为模型：可一次性制备 200–250 张连续切片阵列；荧光三维重构精准锁定目标细胞；三级 SEM 成像清晰呈现纳米级细胞器；完整流程耗时可控，仅目标区高分辨拍摄耗时较长（约 5 天）；配套补充视频直观展示全阵列全景到亚细胞细节的逐级放大效果。同时总结切片弯曲、破损、染色残留、杂质污染等常见操作问题及成因。

2. 相比 SBF/FIB-SEM 的核心优势

样品可完整保存，支持多次复染、多轮不同分辨率重复成像；
切片后重金属后染色，弱金属化、病理存档样本均可适配，无需破坏超微结构做强整体染色；
成像视野更大，可拼接毫米级大体积组织，适合脑连接组、大块病理组织；
硬件门槛低，仅需常规超薄切片机、普通扫描电镜，定制底物载台为唯一特殊配件。

3. 该技术固有局限

Z 轴分辨率受切片厚度限制（如 100 nm 切片），体素各向异性，小于 1 μm 微小结构三维解析能力弱于 FIB-SEM（可实现各向同性 5 nm 体素）；
切片制备过程存在丢失切片、条带褶皱断裂风险，三维重构出现间隙；
自动化程度不足：切片收集、荧光拍摄仍依赖人工，ATUMtome 自动化切片设备搭配 Kapton 膜无法兼容荧光成像；
SEM 载台定位精度有限，拍摄 ROI 需预留更大范围，增加数据量。

4. 适用场景

发育生物学、病理样本三维超微观察、荧光标记细胞的关联电镜成像、大体积组织靶向超微结构分析。

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结果

三维冷冻聚焦离子束/扫描电子显微镜（3D cryo-FIB/SEM）成像技术已广泛应用于软组织、硬组织、亚细胞器及细胞间网络等多层级复杂生物结构的三维形貌解析[5,6]。该技术可实现深度达100微米的连续断层成像，具备对厚样品进行无损三维重构的能力。在完成目标区域的三维体积成像后，如需进一步获取超微结构信息，可在所重建体积的末端切片上实施冷冻提取（cryo-lift-out），借助专用冷冻操作夹具（Kleindiek NanoManipulator）制备适用于冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）分析的薄片样品，从而实现从微米级三维构架到纳米级超微细节的跨尺度结构表征。

结果